《分子语言学》实验教学大纲

序号

实验项目

关键步骤

内容提要

学时

实验

类型

1

实验室基础操作：移液使用步骤与规范

1.液枪使用时需从支架上取下（不用时随手放回支架避免意外掉落与撞击）

2.液样品温度需与吸头一致，避免吸头热胀冷缩导致移液体积偏差

3.液器使用前需核实样品体积并选取合适量程移液枪，避免超量程使用

4.移液枪端垂直插入枪头，稍用力即可上紧枪头。切勿使劲敲击，以免移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而受损。

5.装新吸头后把需要移取的液体吸取、排放两到三次，让吸头内壁形成一道同质液膜，确保移液工作的精度和准度。

6.到第一档，将枪头垂直进入液面3-5毫米；平缓松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部，产生反冲和气泡，导致移液体积不准确。停顿1～2秒钟后，经枪头移出液面，并确保枪头外无液体。

7.头以一定角度贴壁，缓慢将控制按钮按到第一档，稍微停顿1s，待剩余液体聚集后，将控制按钮按到第二档将剩余液体全部压出，慢放控制按钮并弹射枪头。

1.液枪的放置

2.品准备

3.定容量

4.装枪头

5.洗-吸液-排液

4

技术型实验

2

质粒扩增与提取

1.粒干粉以5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；

2.1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；
（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）

3.入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；

4.000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；

5.平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（如果菌落过多，请将质粒稀释后再转化。如果无菌落，请加入10μl质粒离心全涂转化）

6.取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要提取质粒。

7.通过单克隆过夜培养的新鲜菌1.5-5ml到新EP管，6000-8000rpm离心1-2min，尽量去上清；

8.冰盒，放入加了适当浓度的RNase酶的P1 buffer，在收集的菌体沉淀中加入250μl的P1 buffer，并用移液枪打匀；

9.加入250μl的P2 buffer，温和地上下颠倒5-10次混匀，会有黏液状出现；

10.迅速加入350μl的P3 buffer，再轻柔地上下颠倒5-10次混匀（迅速加P3和速度不要太快的混匀不冲突，剧烈震荡有损伤）；

11.有白色絮状或块状出现，12000rpm离心5-10min；

12.转移全部上清液到吸附柱，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液；

13.加入500μl pH=7.5的washing buffer至吸附柱中，4000-6000rpm离心30s-1min，弃废液；

14.重复7步骤再洗两次，如果要去除盐类，可以停留1-2min再离心（加洗液）；

15.空柱12000rpm离心3-5min（这里一定要高速离心，去掉吸附柱里的残留液体，主要是酒精）；

16.转移吸附柱到1.5ml新EP管，常温或加热开盖放置15-30min，挥发干净剩余酒精；

17.轻轻加入65℃，40-50μl左右预热的EB buffer或者ddH2O至吸附柱覆膜中央，静置2min，再12000rpm离心30s-1分钟，保存管中质粒溶液；

1.粒转化大肠杆菌

2.板挑取大肠杆菌单克隆并接种

3.粒提取

4

技术型实验

3

限制性内切酶验证质粒序列

1.  先将样品ep管编号（最好为0.5ml），用微量移液管加入1μgDNA和2μl相应的核酸内切酶反应10x缓冲液，再加蒸馏水使总体积为19μl。将溶液在管中混合后，加入1μl酶溶液。用手指轻拂管壁以混合溶液。使用核酸内切酶时，应将离开冰箱的时间减至最少，以避免活性降低。

2.混合反应体系后，将eppendorf管放在适当的支架上，并在PCR仪中37度2-3小时以完成消化反应。

3.在每个试管中加入2μl0.1mol / L EDTA（pH8.0），充分混合以终止反应，并保存在冰箱中以备后用。

4.取20ml 5×TBE缓冲溶液，加水至200ml，制备0.5×TBE缓冲溶液，备用。

5.胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，放入200ml锥形瓶中，加50ml 0.5×TBE代替缓冲液，放入微波炉中加热至琼脂糖全部融化并摇匀。在加热过程中不时摇动，使附着在瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时盖上密封膜以减少水的蒸发。

6.将琼脂糖倒入模具中，插入样品梳，并观察到梳齿的下边缘应与胶水箱的底面保持约1毫米的间隙。将溴化乙锭添加到冷却至50-60℃的琼脂糖凝胶中（EB溶液转化的最终浓度为0.5μg/ ml）EB溶液浸泡和染色）。浇注过程中的温度不能太低，否则固化会不均匀，速度不能太快，否则很容易出现气泡。凝胶完全固化后，拉出梳子，注意不要损坏梳子底部的凝胶，然后将0.5x TBE缓冲液添加到槽中，直到液位刚好在凝胶表面以下。

7.样品的添加流程：取10μl酶促水解溶液和2μl6X上样溶液混合，小心地用微量移液器将其添加到样品孔中。如果DNA含量低，可以按照上述比例增加样品量，但是在将每个样品添加到总体积后应更换吸头，以防止相互污染。装入样品时要小心，以免损坏凝胶。

8.电泳过程：添加样品后，关闭电泳槽的盖子并立即打开电源。控制电压保持在60-80V，电流大于40mA。当溴酚蓝带移至距凝胶前部约2 cm处时，电泳停止。

9.进行染色：电泳完成后，将无EB的凝胶板转移到0.5μg/ ml EB溶液中，在室温下染色20-25分钟。

10.拍照和进行观察：在长波紫外灯下，在254nm波长下染色或加入EB后，观察电泳胶板， DNA的存在显示出橙红色荧光带，可观测到分离的DNA条带。

1.制性内切酶消化质粒

2.脂糖凝胶电泳分离酶切片段

3.紫外凝胶成像仪检视酶切结果

4

验证型实验